Uso de CRISPR en cardiomiopatía hipertrófica

Se utiliza por primera vez CRISPR en embriones humanos con cardiomiopatía hipertrófica

Un equipo de investigadores ha logrado aplicar por primera vez en Estados Unidos la técnica de edición genética CRISPR-Cas9 para modificar el genoma de embriones humanos. Se ha logrado utilizar CRISPR en embriones sin provocar errores adicionales en su genoma tales como el mosaicismo (alteración que genera poblaciones de células con diferente genotipo).

El estudio se centró en una mutación del gen MYBPC3

Las mutaciones de este gen MYBPC3 conducen a la cardiomiopatía hipertrófica, condición caracterizada por el engrosamiento de los músculos del corazón y que supone la principal causa de muerte súbita en atletas jóvenes (...). El uso de esta técnica es un gran avance médico científico para controlar esta enfermedad y otras en un futuro.

Más información: Genética Médica: Se utiliza por primera vez CRISPR para modificar embriones humanos con cardiomiopatía hipertrófica.

Terapia con Stem Cells en cardiopatías isquémicas

TEMA: Transplante de células madre de médula ósea en pacientes con angina refractaria

Objetivo

Evaluar la eficacia del trasplante autólogo de células madre CD34+ de médula ósea, mediante pre-condicionamiento isquémico en pacientes con angina refractaria.

Tipo de Stem Cell

Células mononucleares de médula ósea (CD34+)

Método de obtención

• Médula ósea: Punción ósea con aguja en la cresta ilíaca posterior.
• Células mononucleares: Gradiente de densidad en sala blanca en condiciones de esterilidad.

Método utilizado

Trasplante de células madre por vía cefálica, basílica o ante cubital en un lapso de 15-20 minutos. La administración de células fueron enviadas en 50 mL de solución salina con 1% de albúmina sérica humana. 

Usos

Neovascularización mediante angiogénesis.

Resultados

Los pacientes intervenidos con este transplante mostraron un aumento en el umbral angina-isquemia, reflejando una mejoría con la tolerancia al ejercicio y clase funcional. 

¿QUÉ SON LAS CÉLULAS MADRE?

Referencia: Transplante autólogo "potenciado" de células madre CD34+ de médula ósea, en pacientes con angina refractaria

Transgénicos en cardiopatías isquémicas

Ratones transgénicos Myh6-miR-24

En un infarto agudo de miocardio, el 25% o más de los cardiomiocitos pueden ser eliminados formando cicatrices, causando disfunción cardíaca y una consecuente insuficiencia. Se buscaron factores que inhiban la apoptosis y regulen la profileración de los miocardiocitos para facilitar la regeneración de corazones lesionados, entre ellos, se encuentran ADN no codificantes: los microRNAs (miR-24). Se ha reportado que estos microRNAs son favorables para la supervivencia celular; es decir, previenen la apoptosis endotelial, aumentando la vascularización y la función cardiaca. Los ratones transgénicos se produjeron por microinyección de la construcción Myh6-miR-24 en embriones de ratón fertilizado. El genoma de los ratones coincide en un 95% con el de los humanos.

Resultados

• La expresión de miR-24 es impulsado por el promotor cardiaco específico Myh6.
• Los ratones transgénicos no mostraron gran diferencia con ratones no transgénicos en condiciones fisiológicas normales.
• Los ratones fueron sometidos a un infarto de miocardio, siendo los ratones transgénicos quienes presentaron disminución en la apoptosis de miocardiocitos. 

Conclusiones

• La sobreexpresión de miR-24 redujo la fibrosis y mejoró la función del corazón, confirmando el papel beneficioso de miR- 24 cuando se expresa en lesión aguda, considerando su utilización como base a terapias cardiovasculares

Referencia: El papel específico de miR-24 en cardiomiocitos en la promoción de la supervivencia celular

 

ADN Recombinante en cardiopatías isquémicas

ADN Recombinante en la naturaleza 

La tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para poder ser insertada en el genoma de otro diferente, ya sea un organismo animal, vegetal, bacteria, hongo o un virus y así producir una proteína que le sea totalmente extraña. La inserción se realiza con enzimas de restricción y enzimas que unen el ADN obteniendo esta molécula de ADN recombinante.

ADN Recombinante artificial

La estreptoquinasa recombinante ha sido utilizada para tratar complicaciones en cardiopatías isquémicas. La rSK se obtiene aislando un gen de Streptococcus pyogenes (1200 pb), el gen se clona in vitro y se transcribe en un vector de expresión eucariota el cual se transforma en la levadura SMD1168. La proteína rSK se purifica y se analiza su efecto fibrinolítico; es decir, a su capacidad de disolver coágulos sanguíneos en embolismo pulmonar, trombosis venosa profunda e infarto agudo de miocardio, principales transtornos de mortalidad a nivel mundial.

  

TÉCNICA DE ADN RECOMBINANTE

 

 Referencias:

• Perspectivas actuales del uso de proteínas recombinantes y su importancia en la investigación científica e industrial
• Producción de estreptoquinasa recombinante a partir del aislamiento de Streptococcus pyogenes y su potencialpara la terapia trombolítica 

Técnicas moleculares en cardiopatías isquémicas

TEMA: Los niveles en sangre de PGC-1α tras infarto agudo de miocardio

 Objetivo

• Evaluar el valor predictivo de los niveles en sangre de PGC-1α en la extensión del área necrótica y el remodelado ventricular tras infarto.

 Tipo de muestra biológica

• Sangre periférica, extraída mediante tubos Vacutainer™ con EDTA

Tipo de ácido nucleico

• ARN total

Técnica molecular utilizada

• Microarrays de ADN

Gen cuantificado

•  PGC-1α

Discusión

• La inducción de PGC-1α se siguió asimismo de un aumento significativo en la expresión de sus dianas génicas citocromo C, manganeso superóxido dismutasa (MnSOD), glutatión peroxidasa (GPx) utilizando sondas específicas.

^{TÉCNICAS MOLECULARES: MICROARRAYS}

 

Referencia: Los niveles en sangre de PGC-1α predice miocardio salvado y remodelado ventricular tras infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST

Técnica de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) en cardiopatías isquémicas

TEMA: Detección de agentes infecciosos en pacientes sometidos a cirugía cardiaca

Objetivos:

1. Identificar la relación entre la infección por el Citomegalovirus, el Virus Herpes Simple, y la Clamydophila pneumoniae con la aterosclerosis en pacientes operados de cirugía cardiaca.
2. Detectar y cuantificar los genomas de estos virus en tejido vascular.

Tipo de muestra biológica

• Suero sanguíneo
• Tejido según el tipo de cirugía (arteria mamaria, aorta ascendente, válvula aórtica o mitral)

NOTA: Las muestras de tejido extraídas no comprometieron con la salud ni vida del paciente, se tomaron muestras que normalmente son resultado de un excedente o desecho de la cirugía.

Tipo de ácido nucleico

• ADN viral, extraído de la muestra de tejido mediante el estuche comercial QIAsmp DNA Mini Kit.

Gen amplificado 

• Fragmento del genoma de los virus. 16sRNA

Tipo de PCR

• PCR en Tiempo Real (q-PCR)

1. Número de Ciclos: 40 
2. Desnaturalización: 20-30 segundos a 95°C 
3. Hibridación: 50-60°C
4. Extensión: 72°C

Visualización: EFO

Discusión

• La evidencia de la presencia de estos microorganismos en las lesiones ateroescleróticas ha emergido interés en múltiples estudios de los últimos años.
• Se utilizan técnicas como: Inmunohistoquímica, microscopía electrónica, hibridación y amplificación de ADN por PCR, amplificación de ARNm y cultivo de microorganismos a partir de lesiones ateromatosas.
  

   

   TÉCNICA DE PCR EN TIEMPO REAL

  
  

   

Referencia: Detección de agentes infecciosos y otros factores asociados a ateroesclerosis en pacientes sometidos a cirugía cardiaca 

Pruebas de tamizaje y pruebas confirmatorias para diagnosticar cardiopatías isquémicas

Pruebas de Tamizaje

Coronariografía invasiva

Ha sido considerada como una prueba gold standar para diagnosticar cardiopatía isquémica mediante una tomografía computarizada de emisión monofotónica de perfusión miocárdica (gated-SPECT).

Gammagrafía Cardíaca de Perfusión (gated-SPECT)

Permite el estudio y la valoración del estado de perfusión miocárdica y la función ventricular. Es usada en pacientes que no pueden alcanzar el 80% de su frecuencia cardíaca máxima. Se establece una sincronización con la onda  R del electrocardiograma y una recolección de 8 imágenes por ciclo cardíaco para reconstruir tomográficamente la silueta del corazón y así interpretar el estado de perfusión de manera visual, evaluando la región miocárdica más isquémica, es decir, aquella que presente un estado de perfusión elevado.

Prueba Confirmatoria

Electrocardiografía

El electrocardiograma es una prueba sencilla no invasiva que no presenta riesgo para el paciente, este método registra la actividad eléctrica del corazón, así como su morfología y funcionamiento. Se lo realiza ante la sospecha de una cardiopatía isquémica; si el paciente acude con un intenso dolor torácico, esto sirve como una diagnóstico si en el ECG se observa una alteración en el segmento ST (en presencia de isquemia).

Referencias:

•  SPECT, angio-TC coronaria, coronariografía invasiva e imágenes de fusión en la cardiopatía isquémica estable
•  Guía de Práctica Clínica de la ESC 2013 sobre diagnóstico y tratamiento de la cardiopatía isquémica estable

 

Alteraciones en la epigenética en cardiopatías isquémicas

En las alteraciones epigenéticas intervienen factores ambientales y genéticos, capaces de cambiar el epigenoma que influya en la expresión de la regulación génica. Ciertos agentes externos como la edad, el cigarrillo, la obesidad y sus co-morbilidades (Hipertensión arterial, Aterosclerosis, Diabletes mellitus II, Enfermedades cerebrovasculares) causadas por un estilo de vida sedentario y una alimentación no muy óptima rica en grasas y carbohidratos, estarían asociadas a un desencadenamiento de cardiopatía isquémica.

Referencias:

• Factores de riesgo en cardiopatía isquémica   
• Cambios epigenéticos registran en el genoma si una persona ha sufrido un ataque al corazón

Alteraciones en la traducción en cardiopatías isquémicas

En la hipertrofia patológica intervienen factores neurohormonales autocrinos y paracrinos (Endotelina 1, Angiotensina II (ANG II), Adrenalina y Noradrenalina). La unión de estos a sus receptores en la membrana activan heterodímeros en la proteína G activando a la Fosfolipasa C (PLC). PLC hidroliza a PIP2 para formar inositol trifosfato (IP3) y diaciglicerol (DAG). IP3 se une a receptores en el retículo sarcoplásmico aumentando el ingreso de calcio al citosol.
El calcio activa a la calcineurina que activa a NFAT, quien es traslocado al núcleo para posteriormente activar genes hipertróficos. Indirectamente la insulina puede inducir a hipertrofia por el aumento de la expresión de RNAm en los receptores de ANG II y la activación del sistema nervioso simpático.

La hipertrofia está mediada por factores de crecimiento: hGH e IGF, cuando estas contactan con sus receptores de membrana activan señales mediadas por fosfotifdilinositol 3 (PI3K) Y AKt. La activavión de AKt activa a mTOR, quien regula la síntesis de proteínas. AKt fosforila e inhibe a la cinasa GSK-3, logrando un efecto de inhibición sobre la maquinaria de síntesis de proteínas y factores transcripcionales importantes implicados en el desarrollo hipertrófico miocárdico.

Referencias: Perspectivas moleculares en cardiopatía hipertrófica

Alteraciones en la transcripción en cardiopatías isquémicas

Los factores de transcripción regulan la expresión genética, entre estos factores encontramos a: NF-kB y FIH-1 a, que actúan rápidamente en la activación de vías de señalización de apoptosis cardíaca (muerte celular programada).

La actividad de este depende de su localización celular, si está en el citoplasma, forma un complejo trimérico con inhibidores IkB transcripcionalmente inactivos. Cuando el IkB se fosforila, sufre ubiquitinación y es reconocido por el proteosoma que lo degrada, liberando al dímero (p50/p65) de NF-kB para luego traslocarse al núcleo en donde activa sus genes blanco.
El sistema cardiovascular es una diana para la acción y producción de citocinas. El NF-kB transcribe moléculas de adhesión celular (ICAM1, VCAM y ELAM1) y genes de citocinas relacionados con procesos de tipo inflamatorio, que al verse aumentadas estarían asociadas al daño y lesión del miocardio. 

Referencias: Los receptores β adrenérgicos en la enfermedad cardiovascular

Alteraciones en la replicación en cardiopatías isquémicas

Se han identificado varios genes que intervienen en el cambio de la secuencia de DNA (mutación o polimorfismo) responsables de las cardiopatías isquémicas. La ateroesclerosis se encuentra asociada a desórdenes del metabolismo de lipoproteínas (apolipoproteínas, LDL) y sus receptores.
La apolipoproteína E es un gen polimórfico en el cromosoma 19 con 3 alelos codominantes (ε2,ε3,ε4). Con la presencia del alelo ε4 de apoproteína E se evidencia una variación en la concentración plasmática de lípidos, causando enfermedades cardiovasculares como: infarto agudo de miocardio o stroke (ictus) por un haplotipo de ALOX5AP, gen que interviene en la codificación de proteínas que están relacionadas con el proceso de ateroesclerosis.

Referencias: Genética de la cardiopatía isquémica: del conocimiento actual a las implicaciones clínicas